多聚泛素化参与鼻咽癌及肺癌发病的分子机制研究

【摘要】蛋白质翻译后修饰参与调控多种生物学行为,近年来对蛋白质翻译后修饰与肿瘤信号转导机制的研究已成为肿瘤学研究的热点。泛素化是蛋白质翻译后修饰的一种重要形式。泛素化修饰在细胞周期调控,细胞生长,凋亡,DNA损伤修复及免疫反应中发挥着重要作用。研究表明,与Lys48结合的多聚泛素链(Ubk48)作为一种信号,介导泛素修饰底物进入26S蛋白酶体,执行降解功能；与Lys63结合的多聚泛素链(Ubk63)介导的泛素化在DNA损伤修复、炎症反应,胞吞及核糖体蛋白合成中起重要作用。泛素信号功能的紊乱参与了人类多种疾病,如肿瘤等的发生发展。鼻咽癌是中国南方高发肿瘤,具有人种和人群的易感性、家族聚集现象、低分化和高转移为主的临床病理特征,其发病与EB病毒感染高度相关。潜伏膜蛋白LMP1是EB病毒编码的重要致瘤蛋白之一。LMP1通过其羧基末端CTAR1和CTAR2功能结构域诱导下游信号通路MAPK,PI3K/Akt,JAK/STAT和NF-κB等的活化,参与调控细胞的增殖、转化与凋亡等一系列的生物学行为。肿瘤抑制基因p53被人们称之为基因组稳定性的“守护神”。p53基因的突变与功能失活是人类肿瘤发病过程中常见的分子事件。在DNA损伤,缺氧和癌基因激活等压力刺激下,p53被激活并促进下游靶基因的表达从而诱导细胞周期阻滞或凋亡发生。翻译后修饰,如磷酸化,泛素化和乙酰化等是调控p53稳定性和功能活性的主要方式。多种与病毒感染相关的肿瘤发病都与p53功能失活密切相关。病毒编码的致瘤蛋白如SV40大T抗原,腺病毒E1B蛋白,HBV编码的X蛋白和HCV编码的核心蛋白等,通过灭活p53信号通路而参与肿瘤的发生发展。与其他肿瘤细胞不同的是,在鼻咽癌中p53基因的突变频率很低(<10%),且出现了p53蛋白积聚的现象。我们前期研究表明,EB病毒编码的致瘤蛋白LMP1通过MAPK信号通路促进p53多个位点的磷酸化从而上调p53稳定性。通过本研究,我们发现LMP1在促进p53表达积聚的同时诱导了其下游靶基因MDM2的表达。LMP1延长了p53与MDM2的蛋白半衰期,但却抑制了MDM2与p53的相互结合。泛素化实验结果表明,LMP1在抑制MDM2介导的p53UbK48泛素化降解的同时,促进了TRAF2介导的p53UbK63泛素化。p53虽然表达上调,但是p53诱导的细胞周期阻滞及细胞凋亡却在LMP1的作用下受到明显抑制。我们的结果首次证实了在鼻咽癌中LMP1通过异常的泛素化修饰调控p53的生理功能从而参与鼻咽癌的发生发展。肺癌是目前高发的恶性肿瘤。尽管分子生物学技术的发展加速了人类对肺癌发病机理的认识,但多年来肺癌患者的5年生存率仍然不足15%,相比35年前13%并没有显著提高。目前肺癌治疗的瓶颈之一是发现新的治疗靶标及克服肺癌细胞的化疗抵抗。Akt信号通路因参与调控细胞增殖,细胞周期演进,细胞存活和能量代谢而在人类多种肿瘤的发生发展中扮演着十分重要的角色。Akt在肿瘤细胞中的持续激活促进了肿瘤细胞的增殖、存活及放化疗抵抗。在多种生长因子的刺激下,Akt被蛋白激酶PDK1和mTORC2分别磷酸化Thr308和Ser473而完全活化。新近研究表明,UbK63介导的多聚泛素化是生长因子诱导Akt激活的必需前提条件。不同的生长因子利用不用的泛素E3酶促进Akt的UbK63多聚泛素化。如在IGF1信号通路中,TRAF6介导了AktUbK63泛素化,但在乳腺癌细胞内,Skp2介导了EGF信号通路中Akt的多聚泛素化。TRAF4最初在人乳腺癌转移淋巴结组织中因基因扩增而被发现。与大多数TRAF家族成员不同的是,TRAF4最重要的生理功能似乎不是参与免疫反应调节,而是参与调控胚胎建成及中枢神经系统发育。新近的研究发现,TRAF4具有潜在的泛素E3酶功能,并参与激活多条信号转导通路。在人类多种肿瘤中TRAF4存在不同程度的基因扩增及蛋白过表达,但TRAF4在肿瘤中的生物学功能还不甚清楚。在本研究中,我们发现TRAF4在肺癌的发生发展过程中具有重要的生物学功能。TRAF4在肺癌细胞和肺癌标本组织中均存在高表达,而在正常肺成纤维细胞和正常肺组织中相对低表达。TRAF4参与调控了EGF诱导的HaCaT细胞恶性转化。基因沉默TRAF4表达能抑制肺癌细胞的恶性表型,包括细胞增殖、停泊非依赖生长,裸鼠成瘤能力等。我们的研究首次证实了在肺癌中TRAF4通过UbK63介导的泛素化修饰参与调控EGF诱导的Akt活化。证实了TRAF4具有泛素E3酶的功能,确定了其潜在的泛素结合酶UbcH5a。Akt是TRAF4泛素化修饰或执行其生物学功能的直接靶标,基因沉默TRAF4明显抑制了肺癌细胞内因Akt高度活化而介导的异常糖酵解。综上,本研究以鼻咽癌、肺癌为研究模型,从UbK63泛素化修饰的角度阐明了EB病毒致瘤蛋白LMP1通过TRAF2调控p53异常积聚参与鼻咽癌变的分子机制,以及肺癌中TRAF4调控Akt活化的分子机制,这为UbK63泛素化修饰参与肿瘤的发病提供了新的实验依据,为寻找靶向泛素化修饰的抗癌药物和基因治疗靶点提出了新的思路。
【作者】李伟；
【导师】曹亚；董子钢；
【作者基本信息】中南大学，基础医学，2013，博士
【关键词】泛素化；p53；TRAF4；Akt；潜伏膜蛋白1；鼻咽癌；肺癌；

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